IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) គឺជាអាណាឡូកនៃស្រទាប់ខាងក្រោម β-galactosidase ដែលអាចបង្កើតបានខ្ពស់។ ក្រោមការបង្កើត IPTG ឧបករណ៍បង្កើតអាចបង្កើតជាស្មុគស្មាញជាមួយប្រូតេអ៊ីនបង្ក្រាប ដូច្នេះរចនាសម្ព័ន្ធនៃប្រូតេអ៊ីនបង្ក្រាបត្រូវបានផ្លាស់ប្តូរ ដូច្នេះវាមិនអាចផ្សំជាមួយហ្សែនគោលដៅបានទេ ហើយហ្សែនគោលដៅត្រូវបានបង្ហាញយ៉ាងមានប្រសិទ្ធភាព។ ដូច្នេះតើកំហាប់ IPTG គួរត្រូវបានកំណត់យ៉ាងដូចម្តេចក្នុងអំឡុងពេលពិសោធន៍? តើកាន់តែធំកាន់តែល្អ?
ដំបូង ចូរយើងយល់ពីគោលការណ៍នៃការបង្កើត IPTG៖ អូប៉េរ៉ុនឡាក់តូស (ធាតុ) របស់ E. coli មានហ្សែនរចនាសម្ព័ន្ធចំនួនបីគឺ Z, Y និង A ដែលអ៊ិនកូដ β-galactosidase, permease និង acetyltransferase រៀងៗខ្លួន។ lacZ បំបែកឡាក់តូសទៅជាគ្លុយកូស និងហ្គាឡាក់តូស ឬទៅជាអាឡូ-ឡាក់តូស; lacY អនុញ្ញាតឱ្យឡាក់តូសនៅក្នុងបរិស្ថានឆ្លងកាត់ភ្នាសកោសិកា ហើយចូលទៅក្នុងកោសិកា; lacA ផ្ទេរក្រុមអាសេទីលពីអាសេទីល-CoA ទៅ β-galactoside ដែលពាក់ព័ន្ធនឹងការលុបបំបាត់ឥទ្ធិពលពុល។ លើសពីនេះ មានលំដាប់ប្រតិបត្តិការ O លំដាប់ចាប់ផ្តើម P និងហ្សែននិយតកម្ម I។ លេខកូដហ្សែន I គឺជាប្រូតេអ៊ីនបង្ក្រាបដែលអាចភ្ជាប់ទៅនឹងទីតាំង O នៃលំដាប់ប្រតិបត្តិករ ដូច្នេះអូប៉េរ៉ុន (មេតា) ត្រូវបានបង្ក្រាប និងបិទ។ ក៏មានកន្លែងភ្ជាប់សម្រាប់កន្លែងភ្ជាប់ប្រូតេអ៊ីនធ្វើឱ្យហ្សែនកាតាបូលីកសកម្ម-CAP នៅខាងលើលំដាប់ចាប់ផ្តើម P។ លំដាប់ P លំដាប់ O និងកន្លែងភ្ជាប់ CAP រួមគ្នាបង្កើតបានជាតំបន់និយតកម្មនៃអូប៉េរ៉ុនឡាក់។ ហ្សែនដែលសរសេរកូដនៃអង់ស៊ីមទាំងបីត្រូវបានគ្រប់គ្រងដោយតំបន់និយតកម្មដូចគ្នា ដើម្បីសម្រេចបាននូវការបញ្ចេញមតិដែលសម្របសម្រួលនៃផលិតផលហ្សែន។
ក្នុងករណីដែលគ្មានជាតិឡាក់តូស អូប៉េរ៉ុងឡាក់ (មេតា) ស្ថិតក្នុងស្ថានភាពបង្ក្រាប។ នៅពេលនេះ សារធាតុបង្ក្រាបឡាក់ដែលបង្ហាញដោយលំដាប់ I ក្រោមការគ្រប់គ្រងនៃលំដាប់ប្រូម៉ូទ័រ PI ភ្ជាប់ទៅនឹងលំដាប់ O ដែលរារាំង RNA ប៉ូលីមែររ៉ាសពីការភ្ជាប់ទៅនឹងលំដាប់ P និងរារាំងការចាប់ផ្តើមចម្លង។ នៅពេលដែលឡាក់តូសមានវត្តមាន អូប៉េរ៉ុងឡាក់ (មេតា) អាចត្រូវបានជំរុញ។ នៅក្នុងប្រព័ន្ធអូប៉េរ៉ុង (មេតា) នេះ សារធាតុជំរុញពិតប្រាកដមិនមែនជាឡាក់តូសខ្លួនឯងទេ។ ឡាក់តូសចូលទៅក្នុងកោសិកា ហើយត្រូវបានជំរុញដោយ β-galactosidase ដើម្បីបំលែងទៅជាអាឡូឡាក់តូស។ ក្រោយមកទៀត ក្នុងនាមជាម៉ូលេគុលរំញោច ភ្ជាប់ទៅនឹងប្រូតេអ៊ីនបង្ក្រាប និងផ្លាស់ប្តូររចនាសម្ព័ន្ធប្រូតេអ៊ីន ដែលនាំឱ្យមានការបំបែកប្រូតេអ៊ីនបង្ក្រាបពីលំដាប់ O និងការចម្លង។ អ៊ីសូប្រូភីលធីអូហ្គាឡាក់តូស៊ីដ (IPTG) មានឥទ្ធិពលដូចគ្នានឹងអាឡូឡាក់តូសដែរ។ វាជាសារធាតុជំរុញដ៏មានឥទ្ធិពលខ្លាំង ដែលមិនត្រូវបានរំលាយដោយបាក់តេរី ហើយមានស្ថេរភាពខ្លាំង ដូច្នេះវាត្រូវបានគេប្រើយ៉ាងទូលំទូលាយនៅក្នុងមន្ទីរពិសោធន៍។
តើធ្វើដូចម្តេចដើម្បីកំណត់កំហាប់ល្អបំផុតនៃ IPTG? យកបាក់តេរី E. coli ជាឧទាហរណ៍។
ពូជបាក់តេរី E. coli BL21 ដែលត្រូវបានវិស្វកម្មហ្សែន ដែលមាន pGEX វិជ្ជមាន (CGRP/msCT) ត្រូវបានចាក់ចូលទៅក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុករាវ LB ដែលមាន 50μg·mL-1 Amp ហើយដាំដុះពេញមួយយប់នៅសីតុណ្ហភាព 37°C។ វប្បធម៌ខាងលើត្រូវបានចាក់ចូលទៅក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុករាវ LB ស្រស់ 50mL ចំនួន 10 ដែលមានផ្ទុក 50μg·mL-1 Amp ក្នុងសមាមាត្រ 1:100 សម្រាប់ការដាំដុះពង្រីក ហើយនៅពេលដែលតម្លៃ OD600 គឺ 0.6~0.8 នោះ IPTG ត្រូវបានបន្ថែមទៅក្នុងកំហាប់ចុងក្រោយ។ វាមាន 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1។ បន្ទាប់ពីការបញ្ចូលថាមពលនៅសីតុណ្ហភាពដូចគ្នា និងពេលវេលាដូចគ្នា ដំណោះស្រាយបាក់តេរី 1 មីលីលីត្រត្រូវបានយកចេញពីវា ហើយកោសិកាបាក់តេរីត្រូវបានប្រមូលដោយការបង្វិលកណ្តាល ហើយត្រូវបានទទួលរងនូវ SDS-PAGE ដើម្បីវិភាគឥទ្ធិពលនៃកំហាប់ IPTG ផ្សេងៗគ្នាលើការបញ្ចេញប្រូតេអ៊ីន ហើយបន្ទាប់មកជ្រើសរើសកំហាប់ IPTG ដែលមានការបញ្ចេញប្រូតេអ៊ីនធំបំផុត។
បន្ទាប់ពីការពិសោធន៍ យើងនឹងឃើញថាកំហាប់ IPTG មិនច្រើនតាមដែលអាចធ្វើទៅបានទេ។ នេះដោយសារតែ IPTG មានជាតិពុលជាក់លាក់ចំពោះបាក់តេរី។ លើសពីកំហាប់ក៏នឹងសម្លាប់កោសិកាផងដែរ។ ហើយជាទូទៅ យើងសង្ឃឹមថាប្រូតេអ៊ីនរលាយកាន់តែច្រើនដែលបង្ហាញនៅក្នុងកោសិកាកាន់តែល្អ ប៉ុន្តែក្នុងករណីជាច្រើន នៅពេលដែលកំហាប់ IPTG ខ្ពស់ពេក បរិមាណដ៏ច្រើននៃការរួមបញ្ចូលនឹងត្រូវបានបង្កើតឡើង។ រាងកាយ ប៉ុន្តែបរិមាណប្រូតេអ៊ីនរលាយថយចុះ។ ដូច្នេះ កំហាប់ IPTG ដែលសមស្របបំផុតជារឿយៗមិនមែនកាន់តែធំកាន់តែល្អនោះទេ ប៉ុន្តែកំហាប់កាន់តែទាប។
គោលបំណងនៃការបញ្ចូល និងការដាំដុះពូជដែលកែច្នៃហ្សែនគឺដើម្បីបង្កើនទិន្នផលនៃប្រូតេអ៊ីនគោលដៅ និងកាត់បន្ថយថ្លៃដើម។ ការបញ្ចេញមតិនៃហ្សែនគោលដៅមិនត្រឹមតែរងផលប៉ះពាល់ដោយកត្តាផ្ទាល់របស់ពូជ និងប្លាស្មីតនៃការបញ្ចេញមតិប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែថែមទាំងដោយលក្ខខណ្ឌខាងក្រៅផ្សេងទៀតផងដែរ ដូចជាកំហាប់នៃសារធាតុបញ្ចូល សីតុណ្ហភាពបញ្ចូល និងពេលវេលាបញ្ចូល។ ដូច្នេះ ជាទូទៅ មុនពេលប្រូតេអ៊ីនដែលមិនស្គាល់ត្រូវបានបង្ហាញ និងបន្សុទ្ធ វាជាការល្អបំផុតក្នុងការសិក្សាអំពីពេលវេលាបញ្ចូល សីតុណ្ហភាព និងកំហាប់ IPTG ដើម្បីជ្រើសរើសលក្ខខណ្ឌសមស្រប និងទទួលបានលទ្ធផលពិសោធន៍ល្អបំផុត។
ពេលវេលាបង្ហោះ៖ ថ្ងៃទី ៣១ ខែធ្នូ ឆ្នាំ ២០២១